Исследование влияния Омега-3 ПНЖК на протеом плазмы при синдроме Ретта

Клаудио Де Феличе, ¹ Алессио Кортелаццо, ^2,3 Синция Сигнорини, ⁴ Роберто Гуэрранти, ³ Сильвия Леончини, ^2,4 Алессандра Пекорелли, ^2,4 Тьерри Дюран, ⁵ Жан-Мари Галано, ⁵ Камиль Огер, ⁵ Глория Золло, ^2,4 Барбара Монтомоли, ² Клаудия Ланди, ⁶ Лука Бини, ⁶ Джузеппе Валаччи, ^7,8 Лючия Чикколи⁴ и Йосеф Хайек²

1. Отделение интенсивной терапии новорожденных, Университетская больница Сиены (AOUS), Виале М. Браччи 16, 53100 Сиена, Италия 
2. Отделение детской нейропсихиатрии, Университетская больница AOUS, Виале М. Браччи 16, 53100 Сиена, Италия 
3. Отделение медицинских биотехнологий, Университет Сиены, Виа А. Моро 2, 53100 Сиена, Италия 
4. Отделение молекулярной и эволюционной медицины, Университет Сиены, Виа А. Моро 2, 53100 Сиена, Италия 
5. Институт биомолекул Макса Муссерона (IBMM), UMR 5247, CNRS/UM1/UM2/ENSCM, BP 14491, 34093 Монпелье, Седекс 5, Франция 
6. Отделение медико-биологических наук, Университет Сиены, Виа А. Моро 2, 53100 Сиена, Италия 
7. Отделение медико-биологических наук и биотехнологии, Университет Феррары, Виа Борсари 46, 44100 Феррара, Италия 
8. Отделение продовольствия и питания, Университет Кёнхи, 1 Хвеги-дон, Тондэмун-гу, Сеул 130-701, Республика Корея

Корреспонденцию следует направлять на имя Синции Сигнорини по адресу cinzia.signorini@unisi.it

Получено 10 октября 2013 года; пересмотрено 4 ноября 2013 года; принято 7 ноября 2013 года

Научный редактор: Пол Эшвуд

Авторское право © 2013 Клаудио Де Феличе и др. Данная статья находится в открытом доступе и распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons «С указанием авторства», которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение работы на любых носителях при надлежащем указании ее автора.

Механизм действия Омега-3 жирных кислот (ω-3 ПНЖК) известен лишь частично. В предыдущем отчете сообщалось о предполагаемом частичном избавлении от клинических симптомов и изменениях окислительного стресса (ОС) после дополнительного введения ω-3 ПНЖК в рацион пациентов с симптомом Ретта (СР), разрушительного неврологического расстройства с переходными признаками аутизма, который встречается почти исключительно у девочек и вызван, главным образом, спорадическими мутациями в гене, кодирующем метил-CpG-связывающий белок 2 – белок MeCP2. В данной работе мы проверили гипотезу о том, что ω-3 ПНЖК могут изменить профиль протеома плазмы у типичных пациентов с синдромом Ретта с мутациями MECP2 и классическим фенотипом. В течение 12 месяцев в рацион 24 девочек с различными клиническими стадиями СР дополнительно вводились ω-3 ПНЖК в виде рыбьего жира, после чего проводилось сравнение с контрольной группой, состоящей из здоровых людей. Экспрессия 16 белков, связанных в основном с острофазным ответом (ОФО), у пациентов, не проходивших лечение, была изменена на этапе включения. После дополнительного введения в рацион ω-3 ПНЖК отмеченный ОФО был частично восстановлен, при этом экспрессия 10 из 16 (62%) белков нормализовалась. ω-3 ПНЖК главным образом влияют на модуляцию ОФО при СР, что дает новое представление о роли воспаления при аутистических расстройствах и открывает путь для новых стратегий лечения.

1. Введение

Внимание к ω-3 полиненасыщенным жирным кислотам (ω-3 ПНЖК) со стороны научного сообщества и широких масс растет на основании того, что эти натуральные молекулы обладают способностью положительно воздействовать на большинство состояний, в частности, благодаря их способности предотвращатьсердечно-сосудистые заболевания. Самыми распространенными ω-3 ПНЖК являются эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) и докозагексаеновая кислота (ДГК), обнаруженные в рыбьем жире, а также альфа-линоленовая кислота C18:3 n-3, полученная из растений. Гипотригли-нцеридемический эффект – наиболее определенная метаболическая реакция ω-3 ПНЖК [1], механизм которой,очевидно, связан с активацией рецепторов, активиру-2 Медиаторы воспаленияемых пролифератором пероксисом [2]. О множестведругих потенциальных положительных эффектах ω-3ПНЖК можно только догадываться. Помимо доказанного или предполагаемого положительного воздействияна сердечно-сосудистую систему (снижение восприимчивости к желудочковой аритмии [3]; антитромбогенный и антиоксидантный эффект [4]; замедление ростаатеросклеротических бляшек путем снижения экспрессии адгезивных молекул и фактора роста тромбоцитов[4]; содействие эндотелиальному фактору релаксациипутем стимулирования производства окиси азота; атакже слабый гипотензивный эффект [5]), также былотмечен более общий, как прямой, так и косвенный,противовоспалительный эффект [6-8]. Тем не менее,молекулярные механизмы, лежащие в основе эффектовω-3 ПНЖК при регуляции воспалительных процессоввсе еще слабо изучены и являются основной областьюисследования [9-11]. Несколько факторов, включая типПНЖК, образование, дозу, продолжительность, возрасти основное заболевание исследуемых субъектов, а также – последнее, но не наименее важное – объективноеизмерение эффектов, могут способствовать пониманию данного вопроса, связанного с липидным обменом.Однако, относительно недавний отчет, посвященныйвзрослым курильщикам [12], показал, что ω-3 ПНЖКспособны оказать влияние на экспрессию белков плазмы крови путем регуляции острофазного ответа (ОФО).

Синдром Ретта (СР) – это разрушительное расстройство, связанное с неврологическим развитием, главным образом, вызванное спорадическими мутациямив гене, кодирующем метил-CpG-связывающий белок 2(MeCP2). СР чаще всего поражает лиц женского пола счастотностью 1:10 000 живорожденных девочек и считается второй по распространенности причиной тяжелых когнитивных нарушений, свойственных этому полу[13]. СР ранее входил в число расстройств аутистического спектра (РАС), хотя существуют очевидные различияс аутизмом [14], и сейчас он не относится к группе РАС.Тем не менее, кратковременные аутистические чертывсегда присутствуют в ходе естественного развития СР.Таким образом, это относительно редкое заболевание на самом деле дает замечательную возможность объективно испытать воздействие ω-3 ПНЖК на аутистическоесостояние, принимая во внимание, что: (1) был выявленустойчивый окислительно-восстановительный дисбаланс [15]; (2) ω-3 ПНЖК были предложены для снижения тяжести фенотипических проявлений и улучшенияокислительно-восстановительного баланса у пациентов,получающих добавки, на нескольких стадиях болезни[15]; (3) сниженный метаболизм холестерина недавнобыл доказан у мышей с СР при отсутствии MeCP2 вслучае лечения статинами, что приводит к улучшениюмоторных симптомов и повышает продолжительностьжизни [16]; и (4) в нашей группе пациентов с СР наблюдались случаи необъяснимой гиперхолестеринемии [17].

Поскольку изучение протенома плазмы при СР проводилось в ходе лишь одного исследования [18], мы предполагаем, что ω-3 ПНЖК могут оказывать влияние на протеном плазмы при СР путем модуляции ОФО.

2. Материалы и методы

2.1. Участники исследования.Исследование проводилосьс участием 24 пациентов женского пола с клиническимдиагнозом «типичный синдром Ретта» (средний возраст 14,4 ± 8,0 лет, возрастной диапазон – 4-33 года) сярко выраженной мутацией гена MECP2 [т.е. T158 M (n = 5), делеция C-концевого сегмента (n = 4), R255X (n =4), R270X (n = з), R133C (n = 2), ранние мутации усечения (n = 1), обширные делеции (n = 1) другие мутации(n = 4)].Распределение клинических стадий было следующим: стадия I (n = 4), стадия II (n = 6), стадия III (n =7), и стадия IV (n = 7).Диагноз СР и критерии включения/невключения основаны на недавно пересмотреннойсогласованной терминологии СР [19, 20]. Все пациентыбыли признаны Национальным справочным центромпо синдрому Ретта Университетской больницы Сиены(заведующий – профессор Йосеф Хаек).

Образцы крови в группе пациентов были взяты во время обычного контрольного исследования при поступлении в больницу, а образцы крови в контрольной группе были получены во время обычных периодическихмедицинских осмотров и сдачи крови. Здоровые испытуемые, входящие в контрольную группу, соответствовали по полу (учитывая, что 98% больных СР женского пола, в контрольную группу были отобраны женщины)и возрасту (основной возраст: 14,4 ± 8,2 лет) пациентов из основной группы. Все исследованные субъектыпридерживались рациона питания, свойственного длясредиземноморских стран. Исследование проводилось содобрения Институтского наблюдательного совета, приэтом было получено информированное согласие родителей или законных опекунов всех пациентов, включенных в исследование.

2.2. Дизайн исследования. Целью настоящего исследования являлась оценка воздействия на протеом плазмыдобавочного введения ω-3 ПНЖК, эффективность которых уже была подтверждена в клинических условиях[21-23].Следовательно, по этическим причинам мы не включили группу плацебо и ограничились исследованием трех популяций субъектов: контрольная группа,состоящая из здоровых людей, группа пациентов с СР, не проходящих лечение, и группа пациентов с СР, дополнительно получавших ω-3 ПНЖК.

2.3. Дополнительное введение в рацион ω-3 ПНЖК.ω-3ПНЖК вводились в виде рыбьего жира (производствакомпании «Norwegian Fish Oil AS», Тронхейм, Норвеnгия, номер продукта HO320-6; итальянский импортер:«Transforma AS Italia», Форли, Италия; регистрациионный код Министерства Италии: 10 43863-Y) в дозе,соответствующей ДГК = 71,9 ± 13,9 мг/кг масса тела/день и ЭПК = 115,5 ± 22,4 мг/кг масса тела/день, с общимсодержанием ω-3 ПНЖК 242,4 ± 47,1 мг/кг масса тела/день. Употребление ЭПК в сочетании с ДГК при СР былоодобрено Этическим комитетом AOUS.

Доза, использованная в данной конкретной когорте девочек превышает стандартную норму в 5-6 раз, которая,как правило, составляет 2 г в день на взрослого человека.Ее обоснование приводилось в предыдущей работе [21],в которой нами была предложена очень высокая дозапри синдроме Ретта. В результате нескольких попытокв клинических условиях была эмпирически определенаокончательная доза в расчете кг/день.

2.4. Сбор образцов. Все образцы пациентов с СР и здоровых субъектов исследования были собраны натощакоколо восьми часов утра. Кровь собирали в гепаринизированные пробирки, и все манипуляции проводились втечение 2 часов после сбора образцов.

2.5. Подготовка образцов. Образцы крови были центрифугированы в количестве 2400 г в течение 15 мин при 4°C;обедненная тромбоцитами плазма была сохранена; лейкоцитарная пленка была удалена отсасыванием. До анар-лиза образцы плазмы хранились при температуре -70°C.2.6. Двумерный гель-электрофорез. Двумерный гель-электрофорез проводился в соответствии с публикацией Горга и др. [24], и образцы, содержащие 60 мкм белка, которое было определено согласно Брэдфорду [25],были денатурированы раствором, содержащим 10%додецилсульфата натрия (ДСН) и 2,3% дитиотреитола(ДТТ), нагретым до 95°C в течение 5 минут. Затем образец соединили с растворяющим буфером, состоящимиз 8 М мочевины, 2% 3-[(3-холамидопропил) диметиламмоний]-1-пропансульфонатом (СНAPS), 0,3% ДТТи 2% буфером с фиксированным градиентом pH (IPG),понесли на полоски геля длиной 18 см с pH 3–10, поместили в установку Ettan IPGphor (GE Healthcare) и регидратировали в течении 7 часов. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) проводилось при 32 кВт-ч. Вначалеполоски были уравновешены в течение 15 минут с помощью буферного раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl,pH 8,8, 6 М мочевины, 2,5% (вес/об.) ДСН, 30% (об./об.)глицерина и 1% (вес/об.) ДТТ, после чего уравновешивание проводилось повторно описанным выше буфернымраствором, в котором ДТТ был заменен 4% (вес/об.) иодоацетамидом.Электрофорез во втором направлениипроводился с помощью электрофоретической системыEttan Daltsix (GE Healthcare). Полоски IPG поместили навертикальный полиакриламидный градиентный гель (8-16% T) толщиной 1,5 мм, залили 0,5% (вес/об.) арагозойи провели электрофорез при постоянном токе 40 мА/гель и температуре 20°C. Каждый образец был представлен в трех повторностях при идентичных условия.

2.7. Анализ изображений. Изображения были проанализированы с помощью компьютерной программыImageMaster 2D Platinum v7.0 (GEHealthcare). Для каждой группы (т.е. контрольная группа, группа пациентов с СР, не получавших ω-3 ПНЖК, и группа пациентовс СР после получения ω-3 ПНЖК) был определен эталонный гель, который использовался для сравнительного анализа. Фон был выведен на основании всех используемых гелей путем определения среднего значенияв пограничном слое. Объем пятна выражался в видеотношения к общему процентному объему белка (%V),определенному во всем геле, чтобы минимизироватьразницы между гелями (нормализация геля) для их объединения. С эталонным гелем сопоставлялись только тепятна, которые были определены во всех гелях одной итой же группы.

2.8. Идентификация белков. После окрашивания серебром, совместимого с масс-спектрометрией, составили и экспортировали в Ettan Spot Picker (GE Healthcare) список для выбора пятен. Пятна вырезали ипоместили в 96-ячеечные микропланшеты, в которых ихобесцветили и удалили остатки воды с помощью ацетонитрила (АЦН) для последующей регидратации с раствором трипсина.Обработка трипсином проводилась втечение ночи при температуре 37° C. Каждое пропитантное трипсином протеиновое пятно (0,75 мл) наносилина мишень МАЛДИ и давали высохнуть. После этоговысушенные образцы обрабатывали 0,75 мл матричногораствора (а-циано-4- гидроксикоричная кислота в 50%АЦН и 0,5% о/о трифторуксусной кислоты) и повторно высушивали.Масс-спектры были получены согласно[27] с помощью системы ultrafleXtreme MALDI-ToF/ToF(Bruker Corporation, Биллерика, Массачусетс, США).После получения массы триптического пептида проводился поиск отпечатка массы по совпадению в базахданных Swiss-Prot/TREMBL и NCBInr с помощью MAS-нCOT (Matrix Science, Лондон, Великобритания, http://www.matrixscience.com/).

2.9. Анализ данных. Все переменные были протестированы на нормальное распределение (тест Д\'Агостино-Пирсона), данные были представлены в виде средних значений и вероятных отклонений. Статистическийанализ белка с дифференциальной экспрессией был выполнен с помощью теста Стьюдентса и однофакторногодисперсионного анализа (ANOVA). Для множественныхтестов использовались поправки Бонферрони. Пятна, неимеющие совпадений, и пятна с существенным отличием в проценте объема считались «дифференциальнойэкспрессией» в данной группе. Сравнения между белками с дифференциальной экспрессией в группе пациентов с СР, не получавшими лечение, и в группе пациентовс СР, принимавшими ω-3 ПНЖК, оценивались с помощью критерия суммы рангов Манна-Уитни или критерия Крускала-Уоллиса. Результаты незначительных раз-4 Медиаторы воспалениямеров популяции на возможную погрешность тип I (a)/тип II при интерпретации данных были рассмотрены спомощью алгоритма объема выборки. Считалось, чтодвусторонний критерий значимости P < 0,05 указываетна статистическую значимость. При этом использовался пакет статистического программного обеспеченияMedCalc версия 12.1.4 (MedCalc Software, Мариакерк,Бельгия).

3. Результаты

Было обнаружено, что экспрессия 16 белков, связанныхв основном с ОФО, у пациентов, не проходивших лечение, была изменена на этапе включения.По сравнению со здоровыми субъектами во всейгруппе пациентов с СР наблюдалось значительное увеличение 10 белковых пятен [т.е. фактор комплемента B(CFAB), альфа-цепь фибриногена (FIBA), сывороточный альбумин (ALBU, пятно №3, фрагмент C-концевого сегмента №7 и фрагмент N-концевого сегмента №14)альфа-1-анти- трипсин (A1AT, пятна №4 и №5), гаптоглобин (HPT, пятна №9 и №15) и транстиретин (TTHYпятно №11)], а также сокращение 6 белковых пятен [т.е.витамин D-связывающий белок (VTDB), аполипопрозтеин A4 (APOA4), кластерин (CLUS), аполипопротеинA1 (APOA1), ретинол-связывающий белок 4 (RET4) итранстиретин (TTHY пятно №16)] (Таблица 1 и Рисунки1(a), 1(b) и 2(a)). Полный список известных биологичееских функций для идентифицированных белков плазмыпредставлен в Таблице 2.

После дополнительного введения в рацион ω-3ПНЖК экспрессия 10 из 16 (62%) белков, как обнаружилось, стала сопоставима с контрольной группой(Рисунок 2(c)). В частности, после приема ω-3 ПНЖКуровни экспрессии белков плазмы были сравнимы сконтрольной популяцией, за исключением постояннойизбыточной экспрессии A1AT (пятно №4), VTDB (пятно№6), фрагмент C-концевого сегмента ALBU (пятно №7)и HPT (пятно №15), а также постоянной недостаточнойэкспрессии FIBA (пятно №2) и ALBU (пятно №3).

Сравнивая профиль белков плазмы в группе пациентов с СР, принимавших ω-3 ПНЖК, с профилем белковдо лечения, было отмечено существенное сокращение9 белковых пятен, которые до лечения имели избыточную экспрессию, включая CFAB, FIBA, ALBU (пятна №3и №14), A1AT, HPT и TTHY (пятно №11), в то же времянаблюдалось существенное увеличение 5 белковых пятен, которые до приема ω-3 ПНЖК имели недостаточную экспрессию: VTDB, APOA4, CLUS, APOA1 и RET4.После дополнительного введения в рацион ω-3 ПНЖКуровни ALBU (пятно №7) и ALBU (пятно №16) осталисьнеизменны по сравнению с группой пациентов в СР, которые не проходили лечение (Таблица 1 и Рисунки 1(a),1(c) и 2(b)).

4. Обсуждение

Механизм действия ω-3 ПНЖК является одним из основных областей исследования, которое в течение последних двух десятилетий привело к открытию протектинов, резолвинов и марезинов, а также всех липидных медиаторов, участвующих в активном разрешении воспалительного процесса [28].

Полученные нами результаты показывают, что ω-3 ПНЖК могут модулировать экспрессию белков плазмы при СР, оказывая значительное влияние на модуляцию ОФО с частичным устранением (приблизительно 62%) белковых изменений, наблюдаемых на исходном уровне.

ТАБЛИЦА 1: Результаты идентификации белков с дифференциальной экспрессией в норме, а также при СР до и после приема ω-3 ПНЖК.

Экспериментальный раздел включает идентификационный номер пятна, название белка и значительный пороговый уровень (P < 0,05). Изменение интенсивности, представленное кратностью, выражено в виде отношения группы СР и контрольной группы, а также отношения до и после введения ω-3 ПНЖК. Положительные кратные изменения означают повышение уровня белков, а отрицательные кратные изменения – снижение уровня экспрессии белка. «—» означает отсутствие существенных изменений. Исследование банка данных белков включает номера доступа к банку данных SwissProt и идентификатор, результат Mascot, покрытие последовательности, количество пептидов, соответствующее последовательности белка и теоретический индекс pl/Mr Х 103. *Сравнение с контрольной группой; **Сравнение с группой пациентов с СР, не принимавших ω-3 ПНЖК.6

РИСУНОК 1: Окрашенный серебром 2-DE гель белков контрольной группы (а), а также группы пациентов с СР, не получавших (b) и получавших (c) лечение.60 мкг общего белка было размещено на нелинейных полосках IPG с диапазоном pH от 3 до 10, после чего был проведен электрофорез в полиакриламидном градиентном геле (8-16% T). Молекулярный вес и pl маркеры обозначены вдоль геля. Числа означают идентифицированные с помощью масс-спектрометрии белковые пятна, указанные в таблицах 1 и 2. Те же белковые пятна указаны в трех репрезентативных образцах геля, принадлежащих (а) контрольной группе, (b) группе пациентов с СР, не получавших лечение и (c) группе пациентов с СР, получавших ω-3 ПНЖК.

Эти результаты согласуются с известными противовоспалительными свойствами данного семейства жирных кислот [29].

ОФО является высоко консервативным адаптивным механизмом [30] и основной составляющей врожденного иммунного ответа. Глубокие изменения происходят в протеоме плазмы вследствие ОФО, отображая высоко регулируемый процесс, который входит в состав более генерализованного перепрограммирования сигнальных событий под влиянием цитокинов. Как известно, вовлеченные в процесс белки (например, белки ОФО), главным образом, синтезируются в печени, а сигнальные события приводят либо к положительной, либо к отрицательной регуляции белков ОФО. Более 200 белков плазмы, как известно, изменяются при ОФО, некоторые из них могут контролировать повреждение тканей и участвовать в их восстановлении, хотя роль данных белков все еще остается гипотетической [31].

РИСУНОК 2: Экспрессия белков плазмы в результате повышения содержания в рационе ω-3 ПНЖК у девочек с классической формой СР с мутацией MECP2. (a) пациенты с СР до дополнительного приема ω-3 ПНЖК: уровни экспрессии сравнительно с контрольной группой; (b) пациенты с СР после дополнительного приема ω-3 ПНЖК: уровни экспрессии сравнительно с группой пациентов, не проходившей лечение; (c) пациенты с СР после дополнительного приема ω-3 ПНЖК: уровни экспрессии сравнительно с контрольной группой. Данные показаны в виде «ящичной диаграммы». Ящичная диаграмма была использована совершенно нетрадиционным способом. Мы пытались визуально представить относительные изменения экспрессии отдельных белков по сравнению с контрольной группой. Представленные переменные соответствуют относительным изменениям: значение «0» показывает отсутствие изменений в экспрессии сравнительно с контрольной группой; положительные значения указывают на повышенную экспрессию, а отрицательные – на недостаточную экспрессию. Существенные изменения были отмечены при анализе ImageMaster; таким образом, числа соответствуют графическому устройству для визуального обнаружения замеченные изменения в уровне белка. Указаны результаты дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса. Звездочки в части (с) указывают на постоянную повышенную экспрессию белков после введения ω-3 ПНЖК сравнительно с контрольными уровнями экспрессии.

Ω-3 ПНЖК во многом оказывают благоприятное влияние на здоровье благодаря, по крайней мере, частично, своему противовоспалительному действию. Недавняя работа [29] демонстрирует, что ЭПК и ДГК являются конкурентами для арахидоновой кислоты (АК) при связывании фермента 5-липоксигеназы, поскольку ω-3 ПНЖК замещает АК в фосфолипидах мембраны, сокращая выработку АК-производных эйкозаноидов (например, простагландин E2), в то же время повышая количество эйкозаноидов, вырабатываемых в результате активации ω-3 ПНЖК. Как сообщалось в ходе нескольких исследований, дополнительный прием ω-3 ПНЖК также может сократить уровень эйкозаноидов, таких как лейкотриен E, в плазме и моче [32-35]. Помимо противовоспалительного эффекта, основанного на прерывании АК-каскада, ω-3 ПНЖК оказывают противовоспалительный эффект через сниженную активацию ядерного фактора каппа-B (NF-KB), мощного стимулятора выработки провоспалительных цитокинов, включая интерлейкин-6 и альфа-фактор некроза опухолей. В целом, обогащение клеточных мембран ω-3 ПНЖК нарушает димерализацию и участие толл-подобного рецептора-4, который может способствовать противовоспалительному эффекту путем подавления активации NF-KB [29]. Еще одно доказательство демонстрирует, что ω-3 ПНЖК могут подавлять липогенез и повышать выработку резольвинов и протектинов, что в итоге приводит к снижению воспаления.Наконец, действие ЭПК и ДГК включает способность к повышению секреции адипонектина, противовоспалительного адипокина [36]. Учитывая воздействие ω-3 ПНЖК на клеточную функцию, их прямая модуляция рецептора, сопряженного с G-белком, заслуживает внимания и может оказать влияние на противовоспалительные свойства. В то же время ω-3 ПНЖК влияют на прямую регуляцию генной экспрессии через ядерные рецепторы и факторы транскрипции, которые, в свою очередь, модулируются внутриклеточными липид-связывающими белками, которые переносят эти жирные кислоты к ядрам. Регуляция генной экспрессии с помощью ω-3 ПНЖК может объяснить изменение белковой экспрессии, о которой мы сообщали в связи с протеомом плазмы при СР, и соответствует предыдущим выводам, полученным при исследовании взрослых курильщиков после кратковременной (т.е. 5 недель) диеты, богатой на ω-3 ПНЖК [12]. В этом последнем исследовании было обнаружено повышение противовоспалительных и антиатеросклерозных свойств белков, связанных с антиоксидантами, при снижении активации комплемента и протеинов ОФО.

В частности, в нашем исследовании основные изменения белков, участвующих в СР (CFAB, FIBA, ALBU (пятно №3 фрагмент C-концевого сегмента и пятно №14 фрагмент N-концевого сегмента), A1AT (пятна №4 и №5) и HPT (пятна №9 и №15)), иммунитет, реакция несвернутых белков (CLUS), свертывание крови (FIBA), транспортные пути (TTHY (пятна №11 и №16), RET4 и VTDB), а также липидный обмен (APOA4 и APOA 1), были замечены при анализе протеома образцов плазмы, взятых у пациентов с типичным СР на различных стадиях с различными генными мутациями MECP2. Повышенная экспрессия белков плазмы у пациентов с СР, не получавших лечение, главным образом, была связана с СР, а недостаточная экспрессия соответствовала отрицательным белкам при СР, реакции несвернутых белков и белков, участвующих в липидном обмене. Наши данные показывают, что ω-3 ПНЖК практически полностью устранили СР, обнаруженный на этапе включения.

Молекулярные механизмы действия ω-3 ПНЖК лишь частично изучены и включают изменения в структуре мембраны и генной экспрессии, прямые взаимодействия с ионными каналами и изменениями в биосинтезе эйкозаноида [28]. Как сообщалось, ЭПК и ДГК, основные ω-3 ПНЖК, конкурируют с АК при преобразовании ферментами цитохрома P450, что приводит к образованию альтернативных физиологически активных метаболитов, учитывая, что ферменты цитохрома P450, как известно, эффективно преобразуют ЭПК и ДГК в эпоксидные и гидроксидные метаболиты (17,18-эпоксиэйкозотриеновую кислоту и 19,20-эпоксиэйкозотриеновую кислоту, соответственно) [37], что, вероятно, может быть опосредовано связано с некоторым благотворным влиянием [38].

Настоящее исследование приводит к мысли о том, что основным положительным эффектом ω-3 ПНЖК (или их вторичных метаболитов) при СР является модуляция непризнанного субклинического воспалительного статуса, что соответствует известным противовоспалительным свойствам этого семейства жирных кислот, а также что многочисленные эффекты, свойственные ω-3 ПНЖК, могут быть связаны с модуляцией ОФО.

5. Вывод

Уже сообщалось о субклиническом воспалительном состоянии у аутистических пациентов с существенными белковыми изменениями в белках, участвующих в воспалительных процессах [39]. В целом, наши выводы о том, что субклинический ОФО при СР может модулироваться с помощью добавки в рацион ω-3 ПНЖК, дает возможность по-новому посмотреть на роль воспалительного процесса при аутистических нарушениях и подтвердить роль ω-3 ПНЖК, действующих в качестве ключевых нутрицевтиков [40].

Сокращения

CFAB: Фактор комплемента В

FIBA: Альфа-цепь фибриногена

ALBU: Сывороточный альбумин

A1AT: Альфа-1-антитрипсин

VTDB: Витамин D-связывающий белок

APOA4: Аполипопротеин A4

HPT: Гаптоглобин

CLUS: Кластерин

TTHY: Транстиретин

APOA1: Аполипопротеин A1

RET4: Ретинол-связывающий белок 4.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Клаудио Де Феличе, Алессио Кортелаццо и Синция Сигнорини внесли одинаковый вклад в данную работу.

Благодарность

Проект настоящего исследования финансируется регионом Тоскана [Бандо Салют 2009, «Добавки антиоксидантов (ω-3 полиненасыщенные жирные кислоты, липоевая кислота) при синдроме Ретта: новый подход к лечению»], Италия. Кроме того, мы благодарны за поддержку Итальянской ассоциации синдрома Ретта (A.I.R., Президент Лючия Довиго), Клубу Киванис и Круглому столу 41 Клуба Сиены, семьям Ненчиони и Тантурли из Фьезоле и Флоренции, а также Лючии Галлуцци из фармацевтического отдела (Galenic Pharmacy) Университетской больницы Сиены. Мы благодарим компанию «Norwegian Fish Oil» (Тронхейм, Норвегия) и д-ра Эцио Тони («Transforma AS Italia», Форли, Италия) за полезную техническую информацию о продуктах из рыбьего жира и доступ к официальным сертификатам контроля качества. Мы искренне благодарны д-рам Пьерлуиджи Тоси, Сильвии Бриани и Роберту Крочи из административного управления Университетской больницы Сиены за постоянную помощь, оказанную в ходе нашего исследования; Роберто Фалери из Центральной медицинской библиотеки (за помощь в библиографическом поиске в сети Интернет). Мы искренне благодарны профессиональному певцу Маттео Сетти (http://www.matteosetti.com/) за счастливый случай, повлекший научные исследования оксидативного стресса, связанного с гипоксией, у девочек с синдромом Ретта и детей, страдающих аутизмом, а также его многочисленные благотворительные концерты и постоянный интерес к научным аспектам нашего исследования. И наконец, мы посвящаем данную работу девочкам с синдромом Ретта и их семьям.

Список литературы

[1] W. S. Harris, M. Miller, A. P. Tighe, M. H. Davidson, and E. J. Schaefer, “Omega-3 fatty acids and coronary heart disease risk: clinical and mechanistic perspectives,” Atherosclerosis, vol. 197, no. 1, pp. 12–24, 2008.

[2] J. Berger and D. E. Moller, “The mechanisms of action of PPARs,” Annual Review of Medicine, vol. 53, pp. 409–435, 2002.

[3] D. S. Siscovick, T. E. Raghunathan, I. King et al., “Dietary intake and cell membrane levels of long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids and the risk of primary cardiac arrest,” Journal of the American Medical Association, vol. 274, no. 17, pp. 1363–1367, 1995.

[4] L. Calabresi, B. Villa, M. Canavesi et al., “An omega-3 polyunsaturated fatty acid concentrate increases plasma high-density lipoprotein 2 cholesterol and paraoxonase levels in patients with familial combined hyperlipidemia,” Metabolism: Clinical and Experimental, vol. 53, no. 2, pp. 153–158, 2004.

[5] W. E. Connor, “Importance of n-3 fatty acids in health and disease,”American Journal of Clinical Nutrition, vol. 71, supplement 1, pp. 171S–175S, 2000.

[6] R. de Caterina, J. K. Liao, and P. Libby, “Fatty acid modulation of endothelial activation,” American Journal of Clinical Nutrition, vol. 71, supplement 1, pp. 213S–223S, 2000.

[7] P. J. Barter, S. Nicholls, K. A. Rye, G. M. Anantharamaiah, M. Navab, and A. M. Fogelman, “Antiinflammatory properties of HDL,” Circulation Research, vol. 95, no. 8, pp. 764–772, 2004.

[8] T. Vaisar, S. Pennathur, P. S. Green et al., “Shotgun proteomics implicates protease inhibition and complement activation in the antiinflammatory properties of HDL,” Journal of Clinical Investigation, vol. 117, no. 3, pp. 746–756, 2007.

[9] C. N. Serhan and N. Chiang, “Resolution phase lipid mediators of inflammation: agonists of resolution,” Current Opinion in Pharmacology, vol. 13, no. 4, pp. 632–640, 2013.

[10] R. Palacios-Pelaez, W. J. Lukiw, and N. G. Bazan, “Omega-3 essential fatty acids modulate initiation and progression of neurodegenerative disease,” Molecular Neurobiology, vol. 41, no. 2-3, pp. 367–374, 2010.

[11] E. Mas, R. J. Woodman, V. Burke et al., “The omega-3 fatty acids EPA and DHA decrease plasma F2- isoprostanes: results from two placebo-controlled interventions,” Free Radical Research, vol. 44, no. 9, pp. 983–990, 2010.

[12] E. Burillo, R. Mateo-Gallego, A. Cenarro et al., “Beneficial effects of omega-3 fatty acids in the proteome of high-density lipoprotein proteome,” Lipids in Health and Disease, vol. 11, article 116, 9 pages, 2012.

[13] M. Chahrour and H. Y. Zoghbi, “The story of Rett syndrome: from clinic to neurobiology,” Neuron, vol. 56, no. 3, pp. 422–437, 2007.

[14] A. K. Percy, “Rett syndrome: exploring the autism link,”Archives of Neurology, vol. 68, no. 8, pp. 985–989, 2011.

[15] C. de Felice, C. Signorini, S. Leoncini et al., “The role of oxidative stress in Rett syndrome: an overview,” Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1259, pp. 121–135, 2012.

[16] C. M. Buchovecky, S. D. Turley, H. M. Brown et al., “A suppressor screen Mecp2 mutant mice implicates cholesterol metabolism in Rett syndrome,” Nature Genetics, vol. 45, no. 9, pp. 1013–1020, 2013.

[17] C. Sticozzi, G. Belmonte, A. Pecorelli et al., “Scavenger receptor B1 post-translational modifications in Rett syndrome,” FEBS Letters, vol. 587, no. 14, pp. 2199–2204, 2013.

[18] V. Matarazzo and G. V. Ronnett, “Temporal and regional differences in the olfactory proteome as a consequence of MeCP2 deficiency,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 101, no. 20, pp. 7763–7768, 2004.

[19] J. L. Neul, W. E. Kaufmann, D. G. Glaze et al., “Rett syndrome: revised diagnostic criteria and nomenclature,” Annals of Neurology, vol. 68, no. 6, pp. 944–950, 2010.

[20] J. L. Neul, P. Fang, J. Barrish et al., “Specific mutations in Methyl-CpG-Binding Protein 2 confer different severity in Rett syndrome,” Neurology, vol. 70, no. 16, pp. 1313–1321, 2008.

[21] C. de Felice, C. Signorini, T. Durand et al., “Partial rescue of Rett syndrome by ω-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) oil,” Genes and Nutrition, pp. 1–12, 2012.

[22] C. Signorini, C. de Felice, S. Leoncini et al., “F4-neuroprostanes mediate neurological severity in Rett syndrome,” Clinica Chimica Acta, vol. 412, no. 15-16, pp. 1399–1406, 2011.

[23] S. Leoncini, C. de Felice, C. Signorini et al., “Oxidative stress in Rett syndrome: natural history, genotype, and variants,” Redox Report, vol. 16, no. 4, pp. 145–153, 2011.

[24] A. Gorg, C. Obermaier, G. Boguth et al., “The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients,” Electrophoresis, vol. 21, no. 6, pp. 1037–1053, 2000.

[25] M. M. Bradford, “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding,” Analytical Biochemistry, vol. 72, no. 1-2, pp. 248–254, 1976.

[26] E. Mortz, T. N. Krogh, H. Vorum, and A. Gorg, “Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis,” Proteomics, vol. 1, no. 11, pp. 1359–1363, 2001.

[27] U. Hellman, C. Wernstedt, J. Gonez, and C. H. Heldin, “Improvement of an “in-gel” digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing,” Analytical Biochemistry, vol. 224, no. 1, pp. 451–455, 1995.

[28] C. N. Serhan, N. Chiang, and T. E. van Dyke, “Resolving inflammation: dual anti-inflammatory and pro-resolution lipid mediators,” Nature Reviews Immunology, vol. 8, no. 5, pp. 349–361, 2008.

[29] D. Mozaffarian and J. H. Y. Wu, “Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease: effects on risk factors, molecular pathways, and clinical events,” Journal of the American College of Cardiology, vol. 58, no. 20, pp. 2047–2067, 2011.

[30] C. Cray, J. Zaias, and N. H. Altman, “Acute phase response in animals: a review,” Comparative Medicine, vol. 59, no. 6, pp. 517–526, 2009.

[31] V. Kumar, A. K. Abbas, N. Fausto, and J. C. Aster, Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, Saunders/Elsevier, 2010.

[32] G. C. Shearer, W. S. Harris, T. L. Pedersen, and J. W. Newman, “Detection of omega-3 oxylipins in human plasma and response to treatment with omega-3 acid ethyl esters,” Journal of Lipid Research, vol. 51, no. 8, pp. 2074–2081, 2010.

[33] K. Nakamura, H. Kariyazono, T. Komokata, N. Hamada, R. Sakata, and K. Yamada, “Influence of preoperative administration of ω-3 fatty acid-enriched supplement on inflammatory and immune responses in patients undergoing major surgery for cancer,” Nutrition, vol. 21, no. 6, pp. 639–649, 2005.

[34] T. D. Mickleborough, R. L. Murray, A. A. Ionescu, and M. R. Lindley, “Fish oil supplementation reduces severity of exerciseinduced bronchoconstriction in elite athletes,” American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, vol. 168, no. 10, pp. 1181–1189, 2003.

[35] C. von Schacky, R. Kiefl, E. Jendraschak, and W. E. Kaminski, “n-3 Fatty acids and cysteinyl-leukotriene formation in humans in vitro, ex vivo, and in vivo,” Journal of Laboratory and Clinical Medicine, vol. 121, no. 2, pp. 302–309, 1993.

[36] N. Siriwardhana, N. S. Kalupahana, and N. Moustaid-Moussa, “Health benefits of n-3 polyunsaturated fatty acids. Eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid,” Advances in Food and Nutrition Research, vol. 65, pp. 211–222, 2012.

[37] C. Arnold, M. Markovic, K. Blossey et al., “Arachidonic acidmetabolizing cytochrome P450 enzymes are targets of ω-3 fatty acids,” Journal of Biological Chemistry, vol. 285, no. 43, pp. 32720–32733, 2010.

[38] G. Zhang, D. Panigrahy, L. M. Mahakian et al., “Epoxy metabolites of docosahexaenoic acid (DHA) inhibit angiogenesis, tumor growth, and metastasis,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 110, no. 16, pp. 6530–6535, 2013.

[39] J. Croonenberghs, E. Bosmans, D. Deboutte, G. Kenis, and M. Maes, “Activation of the inflammatory response system in autism,” Neuropsychobiology, vol. 45, no. 1, pp. 1–6, 2002.

[40] T. Magrone, F. Perez de Heredia, E. Jirillo, G. Morabito, A. Marcos, and M. Serafini, “Functional foods and nutraceuticals as therapeutic tools for the treatment of diet-related diseases,” Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, vol. 91, no. 6, pp. 387–396, 2013.